植物RNA提取試劑盒說明書

RNApure Plant Kit

 Cat. No.   K0588

保存：室溫

組分說明

產(chǎn)品簡介

     本試劑盒用于從各種植物中提取純化高品質(zhì)總 RNA，也適用于真菌菌絲 RNA 的提取。*的 Shredder 分離柱，用于勻質(zhì)化和過濾高粘度的植物或真菌裂解物，同時采用硅基質(zhì)膜吸附 RNA 進(jìn)行純化，使多聚糖等各種污染物通過洗滌被有效去除，經(jīng)洗脫的 RNA 可直接用于各種下游實(shí)驗(yàn)。由本試劑盒提取 RNA 分子量大于 200 堿基，純度高，幾乎無 DNA 殘留。如果是對微量 DNA 非常敏感的 RNA 實(shí)驗(yàn)，殘留的 DNA 可利用無 RNase 的 DNase I 在柱上進(jìn)行消化去除。提取的RNA 可用于 Northern Blot、Dot Blot 、RT-PCR 和體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。

注意事項(xiàng)

1.  預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：

1）使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

2）玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。

3）配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。

4）操作人員戴一次性口罩和手套，實(shí)驗(yàn)過程中要勤換手套。

2.  提取的樣品避免反復(fù)凍融，否則影響 RNA 提取的量和質(zhì)量。

3.  Buffer RL 在使用前請加入β-巰基乙醇，至終濃度為 1%。如 1 ml Buffer RL 加 10  μl  β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的Buffer RL 室溫可保存 1 個月。Buffer RLC 使用時不需加β-巰基乙醇。

4.  第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。

5.  Buffer RL 和 Buffer RLC 如果產(chǎn)生沉淀，請加熱使其溶解后室溫放置。

6.  所有離心步驟若無特殊說明均在室溫下進(jìn)行，且所有操作步驟動作要迅速。

7.  若下游實(shí)驗(yàn)對 DNA 非常敏感，建議用不含 RNase 的 DNase I（貨號：YJ2090A）對 RNA 進(jìn)行處理。

自備試劑：β-巰基乙醇、無水乙醇（新開封或提取RNA專用）  

操作步驟

1.   取植物新鮮組織50-100 mg，加入液氮迅速研磨成粉末。

2.   將研磨后的粉末收集到離心管（自備）中，加入600  μl Buffer RL（使用前檢查是否加入β-巰基乙醇）或Buffer RLC，渦旋振蕩使其充分裂解。

     注意：1）Buffer RL主要成分為異硫氰酸胍，適用于大多數(shù)植物組織的裂解。但有些植物組織（如玉米的胚乳），由于次級代謝產(chǎn)物較特殊，異硫氰酸胍使樣品產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致RNA提取效果不佳，此時可加入Buffer RLC替代Buffer RL。

            2）56℃孵育1-3分鐘有助于組織的裂解，但是淀粉含量高的植物不要進(jìn)行高溫孵育。

3.   將步驟2所得全部液體轉(zhuǎn)移至已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的過濾柱（Shredder Spin Column）中，12,000rpm（~13,400×g）離心2分鐘，將收集管中的上清液轉(zhuǎn)移到一個新的離心管（自備）中。

     注意：1）在吸取液體時可以將槍頭尖端剪掉，便于取樣。

            2）Shredder Spin Column可以除去大部分的碎片，但仍會有小部分流出，離心后會在收集管內(nèi)形成沉淀，在進(jìn)行下一步時注意避免吸到沉淀。

4.   在步驟3所得干凈的裂解液中加入0.5倍體積的無水乙醇，迅速混勻。

     注意：加入乙醇后可能會產(chǎn)生沉淀，但不影響后續(xù)試驗(yàn)。

5.

     將步驟4得到的溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RM）中，若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請分兩次轉(zhuǎn)入。10,000 rpm（~11,500×g）離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6.   向吸附柱中加入700  μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

     可選步驟：如果要進(jìn)行對微量DNA非常敏感的RNA實(shí)驗(yàn)，則用以下步驟替代步驟6。

     1）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心15秒，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

     2）配制DNase I 混合液：取52  μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1 U/μl），混勻， 配制成終體積為80  μl 的DNase I混合液。

         注意:  以上體系為按照我公司產(chǎn)品DNase I （K2090A）反應(yīng)體系進(jìn)行配置，應(yīng)用其他公司產(chǎn)品請參考相應(yīng)說明書。

     3）向吸附柱中直接加入80 µl DNase I混合液，20-30℃孵育15分鐘。

     4）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心15秒，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7.   向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無水乙醇）, 10,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

8.   重復(fù)步驟7。

9.   12,000 rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以*晾干。

     注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇?xì)埩魰绊懞罄m(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR等)。

10.  將吸附柱置于一個新的無RNase離心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中間部位懸空加入30-50  μl RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，10,000 rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

 注意：1）  RNase-Free Water 體積不應(yīng)小于 30 μl，體積過小影響回收率。

2）  如果要提高RNA的產(chǎn)量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復(fù)步驟10。

3）  如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟10。

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