CCK-8試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)水平。用純化的待測(cè)物質(zhì)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入待測(cè)物質(zhì)，再與HRP標(biāo)記的待測(cè)物質(zhì)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測(cè)物質(zhì)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中待測(cè)物質(zhì)濃度。

　　CCK-8試劑盒的技術(shù)流程：

　　1、用緩沖液將抗體稀釋至1-10ug/ml。在反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次。

　　2、加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.05ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。

　　3、加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體0.05ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

　　4、加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

　　5、終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6、結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

　　CCK-8試劑盒使用注意事項(xiàng)：

　　（1）所有試劑應(yīng)按照適合溫度儲(chǔ)存。請(qǐng)勿反復(fù)凍融。

　　（2）使用后均需要對(duì)操作區(qū)進(jìn)行消毒，消毒方式可以采用75%乙醇或核酸消除劑等。耗材均需使用商品化的無(wú)酶耗材。

　　CCK-8試劑盒樣本注意事項(xiàng)：

　　（1）細(xì)胞在含/不含血清的環(huán)境中均可直接使用試劑盒。

　　（2）擴(kuò)增2kb以?xún)?nèi)片段，細(xì)胞樣品濃度不超過(guò)1000個(gè)細(xì)胞。如若擴(kuò)增片段超過(guò)2kb，可適當(dāng)提高細(xì)胞濃度。

　　（3）不同組織使用不同的眼科剪和眼科鑷進(jìn)行處理，防止交叉污染導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏差。

　　CCK-8試劑盒使用過(guò)程中注意事項(xiàng)：

　　（1）PCR過(guò)程中推薦使用陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

　　（2）整個(gè)過(guò)程中使用的吸頭、離心管等耗材應(yīng)丟棄在含有75%乙醇或核酸消除劑的容器中，防止形成環(huán)境污染。

　　（4）PCR產(chǎn)物3’末端含有A，可直接進(jìn)行TA克隆。