一氧化氮 (Nitric oxide ，NO) 含量測定試劑盒說明書

微量法

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

NO  (Nitric Oxide ，NO) 廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng) 中，特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的信息物質(zhì)，發(fā)揮信號傳遞的作用，是 一種新型的生物信使分子，在機(jī)體的生理、病理過程中起著重要的作用。

測定原理：

NO在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成 NO2-，在酸性條件下，NO2-與重氮鹽磺酸胺生成重氮 化合物，進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰，測定其吸光值，可以 計算NO含量。為了排除樣品色素等的影響，每個樣品需做對照管。

自備實驗用品及儀器：

天平、研缽或勻漿器、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96  孔板、蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 100mL×1  瓶，4℃保存。

試劑一：液體 3mL×1  瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體 3mL×1  瓶，4℃保存。

試劑三：液體 6mL×1  瓶，4℃避光保存。

樣品處理：

1.  組織：按照組織質(zhì)量 (g) ：提取液體積(mL)為1：5~ 10的比例 (建議稱取約0. 1g組織，加入 1mL提取液) 進(jìn)行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心 15min ，取上清，置冰上待測。

2.  細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量 (104個) ：提取液體積 (mL) 為500~ 1000：1的比例 (建議500 萬細(xì)胞加入1mL提取液) ，冰浴超聲波破碎細(xì)胞 (功率300w ，超聲3秒，間隔7秒，總時間 3min ) ；然后10000g ，4℃ ，離心 15min ，取上清置于冰上待測。

3.  體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品：直接測定。

測定步驟和操作表：

1 、  分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至550nm。

2 、  操作表

NO  含量計算：

a.    用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.016x-0.0103 ，R2=0. 9986

1 、組織樣品：

NO含量定義：25℃時，每克樣品或每毫克蛋白15min生成1μmoL NO2-，相當(dāng)于1μmoL NO。

(1) 按樣本質(zhì)量計算

NO  含量 (μmoL/g) =  (A 550 +0.0103) ÷0.016×V  反總÷  (V  樣÷V  樣總×W) ×10 -3

= 0. 125×  (A 550 +0.0103) ÷W

(2) 按樣本蛋白濃度計算

NO  含量 (μmoL/mg prot) =  (A 550 +0.0103) ÷0.016×V  反總÷  (V  樣×Cpr) ×10 -3 = 0. 125×  (A 550 +0.0103) ÷Cpr

2 、其他樣品：

NO  含量定義：25℃時，每升樣品15min生成 1μmoL NO2- ，相當(dāng)于1μmoL NO。 NO  含量 (μmoL/L) =  (A 550+0.0103) ÷0.016×V  反總÷V  樣

= 125×  (A 550+0.0103)

V  反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V  樣：反應(yīng)中樣品體積，0. 1mL；V  樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL

b.  用 96  孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y= 0.008x-0.0103 ，R2=0. 9986

1 、組織樣品：

NO含量定義：25℃時，每克樣品或每毫克蛋白15min生成 1μmoL NO2-，相當(dāng)于1μmoL NO。 (1) 按樣本重量計算

NO  含量 (μmoL/g) =  (A 550 +0.0103) ÷0.008×V  反總÷  (V  樣÷V  樣總×W) ×10 -3

= 0.25×  (A 550+0.0103) ÷W

(2) 按樣本蛋白濃度計算

NO  含量 (μmoL/mg prot) =  (A 550+0.0103) ÷0.008×V  反總÷  (V  樣×Cpr) ×10 -3 = 0.25×  (A 550+0.0103) ÷ Cpr

2 、細(xì)胞

NO  含量定義：25℃時，每104個細(xì)胞15min  生成 1μmoL NO2- ，相當(dāng)于1μmoL NO。

NO  含量 (μmol/104cell) = (A 550+0.0103) ÷0.008×V反總÷ (V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量) ×10 -3= 0.25×  (A 550+0.0103) ÷細(xì)胞數(shù)量 (萬個)

3 、  其他樣品：

NO  含量定義：25℃時，每升樣品 15min  生成 1μmoL NO2- ，相當(dāng)于1μmoL NO。

NO  含量 (μmoL/L) =  (A 550 +0.0103) ÷0.008× V  反總÷V  樣= 250×  (A 550 +0.0103)   V  反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V  樣：反應(yīng)中樣品體積，0. 1mL；V  樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL

注意事項：

1.  試劑盒 2-8℃保存。

2.  盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測，試劑三有腐蝕性，操作時請做好防護(hù)措施。

3.  若檢測出得 OD  值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍外，請將樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐饪s或稀釋，并在計算公式 中除以濃縮倍數(shù)或者乘以稀釋倍數(shù)。

4.  最DI檢出限為 0.65μmoL/L。

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