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底物范圍較廣，包括二氨基聯苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。
二氨基聯苯胺／金屬鹽
DAB是辣根過氧化物酶最敏感、常用的底物。它產生強烈的棕色產物，在水和醇中不溶解。多數情況下，推薦在DAB中加入不同的金屬離子。當加入金屬鹽如鈷、鎳至底物液中，辣根過氧化物酶可以更加敏感。此類反應產物呈暗藍灰色至黑色，且在水及醇中穩(wěn)定。DAB／金屬鹽染色應用的組織染色范圍較廣。
1．需要的溶液和特殊設備
DAB，0．05mol／LTris緩沖液(pH7．6)；
0．3％(W／V)氯化鎳／水貯存液；
30％過氧化氫；
DPX。
光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果)
2．操作步驟
(1)用9ml 0．05mol／L Tris緩沖液(pH7．6)溶解6mgDAB；
(2)加lml 0．3％(W／V)氯化鎳／水貯存液(也可以用等量的氯化鈷替代)；
(3)加0．1 m1 3％過氧化氫。過氧化氫一般以30％的溶液提供，貯存在4E，此條件可以持續(xù)1個月；
(4)如果出現沉淀，用濾紙過濾；
(5)加此溶液至標本，并孵育1—20min水洗終止反應；
(6)優(yōu)化：如果需要可復染；
(7)用DPX封片。
氯萘酚
氯萘酚可以形成一種藍黑色產物。敏感性低于DAB，且產物可溶于醇中。它適用于當DAB反應形成較高背景或要求改變產物的顏色。
1.需要的溶液和特殊設備
0，03％氯萘酚，用無水乙醇溶解(貯存在-20℃)，0．05mol／LTris(pH7．6)
過氧化氫；
Gelvatol或者Mowiol。
光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果)。
2．操作步驟
(1)氯萘酚貯存液的準備：用10ml無水乙醇溶解0．3g氯萘酚，貯存于—20℃；
(2)加100ul氯萘酚貯存液至10ml 0．05mol／LTris(pH7．6)，
(3)加0．1ml 3％過氧化氫于水中。過氧化氫一般是以30％的溶液提供，4℃可存放1個月；
(4)白色沉淀可用濾紙過濾去除；
(5)加此溶液到標本中，并在室溫孵育10～40min，水洗終止反應；
(6)優(yōu)化：如果需要，進行復染，但只可使用水溶性染料；
(7)用Gelvatol或者Mowiol封片。
氨乙基咔唑
氨乙基咔唑(AEC)產生紅色產物，其敏感性低于DAB，但可用于DAB反應產生較高背景或要求改變產物顏色的試驗。此產物可溶于醇，但不溶于水。
1．需要的溶液和特殊設備
0．4％AEC用N，N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解；
0．1mol／L乙酸鈉緩沖液(pH5．2)；
過氧化氫；
Gelvatol或Mowi01．
光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果)。
2．操作步驟
(1)用lmlDMF溶解4mgAEC。AEC在DMF中穩(wěn)定，因此，可以用100mlDMF溶解0．4gAEC作為貯存液備用；
(2)加lmlAEC溶液至15ml 0．1mol／L的乙酸鈉緩沖液(pH5．2)中，并攪拌；
(3)加0．15ml 3％過氧化氫于水中。過氧化氫一般是30％的溶液提供，在4℃可存放1個月；
(4)用濾紙過濾；
(5)加此溶液到標本中，并于室溫孵育10～40min，水洗終止反應；
(6)優(yōu)化：如果需要復染，只可用水溶性染料；
(7)用Gelvatol或Mowiol封片。
