HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒說明書

HiFi-MMLV One Step RT-PCR Kit

HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒

目錄號：YJ0745

保存條件：-20℃保存。

組分說明

           Cat. No.                                   YJ0745

           Kit Size                                      100

           HiFi-MMLV OneStep RT-    PCR EnzymeMix       50 μl

           2×OneStep RT-PCR Buffer                      1.4 ml

           RNase-Free Water                             1 ml

            本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途  

產品簡介

　　本試劑盒是專為一步法RT-PCR實驗研制，逆轉錄和PCR在同一反應體系中進行，

反應過程中無需添加試劑，無需打開管蓋，在避免污染的同時提高了檢測靈敏度和實驗

效率。本試劑盒包括逆轉錄酶、快速熱啟動   DNA聚合酶，同時包含適用于逆轉錄和

PCR擴增的反應緩沖液和實驗中所必需的反應組分。HiFi-MMLV逆轉錄酶RNase H活性

缺失，減少了逆轉錄反應中RNA的降解。HiFi-MMLV逆轉錄酶熱穩(wěn)定性強，可獲得高產

量的cDNA。PCR反應使用的快速熱啟動DNA聚合酶具有擴增效率高、延伸速度快的優(yōu)

良性能。*的緩沖體系使逆轉錄酶和聚合酶同時發(fā)揮zui大功效。使用本試劑盒擴增得

到的目的產物3′端附有一個″A″堿基，可直接用于T/A克隆。

注意事項

1．在操作過程中應避免RNase污染，防止RNA降解或實驗中的交叉污染，建議在專門

   的區(qū)域進行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經

   常更換手套。

2．實驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙

   酯）水溶液在37℃處理12小時，并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用，或者將玻璃

   器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應使用 0.1%的DEPC

   處理后進行高壓滅菌。

3．本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經短暫離心

   后使用。所涉及的酶類使用后應盡快放回-20℃，避免反復凍融。

4．本試劑盒必須使用特異性引物，引物的選擇可根據(jù)具體實驗來選擇，引物設計的好

   壞直接影響到RT-PCR  反應的結果，設計引物時需考慮GC含量，引物長度，引物

   位置，PCR產物的二級結構等因素，建議采用專業(yè)的引物設計軟件來設計。

使用方法

1．將RNA模板、引物、  OneStep RT-PCR  Buffer、OneStep  RT-PCR  EnzymeMix

   和RNase-Free  Water溶解并置于冰上備用。

2．根據(jù)以下表格配制反應體系：

 試劑                                       25 μl反應體系         終濃度

2×One Step RT-PCR Buffer                      12.5 μl          1×

Forward Primer，10 μM                            1 μl         0.4 μM

Reverse Primer，10 μM                            1 μl         0.4 μM

HiFi-MMLV OneStep RT-PCR EnzymeMix             0.5 μl

RNA Template                                   X μl        10 pg –1 μg

RNase-Free water                            up to 25 μl

   注意：引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應體系。

3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。

4．將熱循環(huán)儀預熱到45℃，將PCR管置于熱循環(huán)儀中，進行RT-PCR反應。

   反應條件：

                  步驟            溫度        時間

                 反轉錄            45℃      30 min

               PCR預變性           95℃       2 min

                  變性            94℃       30 s

                  退火          55-65℃      30 s    30-40個循環(huán)

                  延伸            72℃       30 s

                 終延伸            72℃       5 min

   注意：1）一般PCR實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時間一般為20-30秒，無法得到理想的擴增效率時，適當降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應時，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應條件。

   2）延伸時間根據(jù)擴增的片段大小設定，本產品中包含的DNA Polymerase擴增效率為1 kb/30s。

   3）可根據(jù)擴增產物的下游應用設定循環(huán)數(shù)。循環(huán)次數(shù)太少，擴增量不足；循環(huán)次數(shù)多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以，在保證產物得率的前提下，應盡量減少循環(huán)次數(shù)。

5．反應結束后取5 μl反應產物，加入適量上樣緩沖液后進行電泳檢測結果。

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