β-葡萄糖苷酶（β-GC)活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

注意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

微量法

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 12mL 雙蒸水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。試劑三：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1mL×1 支，5μmol/mL 的對(duì)硝基苯酚溶液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

β-GC（EC 3.2.1.21）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化β-糖苷鍵水解，具有多方面生理作用：在纖維素的糖化作用中，β-GC 負(fù)責(zé)進(jìn)一步水解纖維素二糖和纖維素寡糖生成葡萄糖；β-GC 水解萜烯類(lèi)香氣前驅(qū)體，使糖苷鍵合態(tài)變成游離態(tài)。從而產(chǎn)生香味；β-GC 能夠水解植物體內(nèi)野黑櫻苷，釋放 HCN，從而防止昆蟲(chóng)取食。

β-GC 分解對(duì)-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成對(duì)-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算β-GC 活性。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 1000 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 20％，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），15000g， 4℃，離心 20min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織的處理：稱(chēng)取約 0.2g 組織，加入 1mL 提取液進(jìn)行冰浴勻漿；15000g，4℃，離心 20min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、標(biāo)準(zhǔn)樣品的準(zhǔn)備：取 100μL 標(biāo)準(zhǔn)液，加入到 400μL 試劑三中，得到 1μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液，十倍稀釋到 100nmol/mL，用蒸餾水倍比稀釋?zhuān)?0、25、12.5、6.25nmol/mL。100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL 做標(biāo)準(zhǔn)液。

二、測(cè)定步驟

1.分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 400nm，蒸餾水調(diào)零。

2.加樣表

試劑名稱(chēng)（μL）測(cè)定管對(duì)照管標(biāo)準(zhǔn)管

試劑一120

試劑二150150

樣本3030

充分混勻，放入 37℃準(zhǔn)確水浴 30min 后，立即放入沸水浴中煮沸 5min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）

充分混勻，8000g，4℃，離心 5min，取上清液（在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置 2min 后，400nm 處測(cè)定吸光值 A，計(jì)算ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。三、β-GC 活力計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（y）和吸光度（減去濃度為 0 標(biāo)準(zhǔn)管的 OD 值，x），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA（x）帶入公式計(jì)算樣品產(chǎn)物濃度（nmol/mL）。

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(U/mg prot)=(y×V 反總)÷(V 樣×Cpr)÷T=20×y÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織在每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(U/g 鮮重) = (y×V 反總)÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=20×y÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(U/104 cell)=(y×V 反總)÷(1000×V 樣÷V 樣總)÷T=0.02×y

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品鮮重，g；1000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，1000 萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h。

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